澳门永利PCR反应条件的优化

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核心提示:1、 温度与时间的设置:
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90

核心提示:1. 变性:在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min
非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶,这样可减少

核心提示: 聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、 快速

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain
Reaction)的简称,是一种常用的分子生物学技术。PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物,有时甚至没有目的产物;而在另一个极端,又可能没有扩增到任何产物。PCR反应条件包括:温度、时间和循环次数。下面贤集网小编给您介绍一下PCR反应条件的设置。

1、 温度与时间的设置:

  1. 变性:在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA
    完全解链,然后加入Taq
    DNA聚合酶,这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR
    失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA
    产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA
    解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC
    的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

  2. 退火:这是PCR
    的一个关键参数。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm
    低5℃,
    当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物Tm
    不同,将退火温度设定为比最低的Tm
    低5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5
    个循环,然后在根据较低Tm
    设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度完成整个扩增循环,
    既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。

  3. 延伸:延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA
    聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA
    聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq
    DNA聚合酶每分钟约可合成1kb
    长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,
    则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,
    这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

  4. 循环次数: 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA
    浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR
    产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA
    聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的DNA
    样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60
    轮循环后,
    扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C=Con
    。其中:C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n
    为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应,减少非特异性产物。

聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、 快速、
简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

1、温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40
~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA
聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq
DNA酶仍有较高的催化活性)。①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA
比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5~10℃)在Tm值允许范围内,
选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。③延伸温度与时间:Taq
DNA聚合酶的生物学活性:70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子70℃
60核苷酸/S/酶分子55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃时,
DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。2、循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40
~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA
聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因可采用二温度点法,
除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸。

PCR技术简史

1.
变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下93℃~94℃1min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高,则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关,DNA分子越长,在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短,则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性,当PCR循环中的反应温度降低时,部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA,从而导致PCR的失败。

PCR的最早设想
核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

2.
退火温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA
比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。一般退火温度在40~60℃之间,时间为30~45s,足以使引物与模板之间完全结合。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。如果低于50%,退火温度应低于55℃。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis
等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件—摸板DNA
,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

Tm值=4+2 复性温度=Tm值-【引物长度在15~25bp可通过公Tm=×4℃
×2℃计算退火温度】:

PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I
的Klenow片段,其缺点是:①Klenow酶不耐高温,
90℃会变性失活,每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

较高的退火温度可提高反应的特异性。在Tm值允许范围内,应尽量选择较高的复性温度。

1988年初,Keohanog改用T4
DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。

  1. 延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:70~80℃
    150核苷酸/S/酶分子;70℃ 60核苷酸/S/酶分子;55℃
    24核苷酸/S/酶分子;高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。

1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 中提取到一种耐热DNA聚合酶。
此酶具有以下特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I
Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内,一般在70~75℃。常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定,通常对于1kb以内的片段1min是够用的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

PCR技术的基本原理

2、 循环数:

PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA
链互补的半保留复制链重复循环变性–退火–延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,
2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

循环次数决定着扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下,循环次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数,此外还会导致PCR反应“平台效应”的出现;循环数太少会影响正常的PCR产物量。常规PCR一般为25-40周期较合适,具体要多少循环数可通过预试验确定。在其他参数交已优化的条件下,最适循环数取决于靶序列的初始浓度,模板DNA分子数
需要热循环次数参照:3.0×105 25-301.5×104 30-351.0×103 35-4050
40-45

。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝

3、 PCR产物积累规律:

PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA
扩增量可用Y=n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA
片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期, 即出现“停滞效应”
,这种效应称平台期数、PCR
扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。

反应初期产物以2n呈指数形式增加,至一定的循环数后,引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡,产物进入一个缓慢增长时期,即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关.

PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,
以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸, 其5’端是固定的,3′
端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链结合。引物在与新链结合时,
由于新链模板的5’端序列是固定的,
这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点,
保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,
而“长产物片段”则以算术倍数增加, 几乎可以忽略不计,
这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系

10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10~100pmol 模板DNA
0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至
100ul PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR
产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,
就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则:

①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度:
以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,
这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量:
每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应,
一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M
NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,
-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等,如其中任何一种浓度不同于其它几种时,就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

模板核酸
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS
还能与蛋白质结合而沉淀;
蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq
DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置:
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40
~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA
聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因可采用二温度点法,
除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸。

①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。

②退火温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA
比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值=4+2 复性温度=Tm值- 在Tm值允许范围内,
选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,
提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时,
DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够
的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点

特异性强:

PCR反应的特异性决定因素为: ①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则; ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq
DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU;在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速

PCR反应用耐高温的Taq
DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4
小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA
粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

PCR扩增产物的分析

PCR产物是否为特异性扩增
,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论。PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

凝胶电泳分析:PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件。

琼脂糖凝胶电泳: 通常应用1~2%的琼脂糖凝胶, 供检测用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳:6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析。

酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。

分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR
产物碱基突变的有效方法。

Southern印迹杂交:
在两引物之间另合成一条寡核苷酸链标记后做探针,与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研。

斑点杂交:
将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

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